T4 Polynucleotide Kinase(5-20U/μl)
10×Protruding End Kinase Buffer [PNK-1P]
10×Blunt End Kinase Buffer [PNK-1B]
Denaturation Buffer [PNK-1D]
 

组成:
50mM Tris-HCl (pH7.5)
0.1mM EDTA
1mM DTT
50mM KCI
0.1μM ATP
50% Glycerol

10×Protruding End Kinase Buffer [Code No. PNK-1P]组成:
 500mM Tris-HCl (pH8.0)
 100mM MgCl₂
 50mM DTT

10×Blunt End Kinase Buffer [Code No. PNK-1B]组成:
 500mM Tris-HCl (pH9.5)
 100mM MgCl₂
 50mM DTT

Denaturation Buffer [Code No. PNK-1D]组成:

20mM Tris-HCl (pH9.5)
1mM Spermidine
0.1mM EDTA

活性的定义:
 以用Micrococcal Nuclease活化的小牛胸腺DNA为底物，在37℃、pH7.6下，30分钟内将1nmole的[γ-³²P]rATP摄入为酸不溶性沉淀物所需的酶量为1U。

来源:
  E.coli 重组体
 
纯度:
10U的本酶和1μg的λDNA/HindⅢ分解物在37℃下反应20小时，DNA的电泳模式未见变化。
在活性测定条件下，本酶和1μg的[³H]-E.coli DNA进行反应，游离为酸可溶性组分时放射能活性为0.01%/小时/U以下。
 

<单链及5'末端突出的双链DNA的标记>
灭菌蒸馏水   Xμl
底物DNA     5-20pmoles
10×Protruding End
Kinase Buffer  10μl
[γ-³²P]rATP(10mCi/ml) 10μl
T4 Polynucleotide Kinase 20U
Total Volume  100μl
↓
37℃, 60min.

<平滑末端及3'末端突出的双链DNA的标记>
灭菌蒸馏水 Xμl
底物DNA 5-20pmoles
Denaturation Buffer 75μl
Total Volume 75μl
↓
90℃, 2min.
冰上急剧冷却
↓
add:
10×Blunt End
Kinase Buffer 10μl
[γ-³²P]rATP(10mCi/ml) 10μl
T4 Polynucleotide Kinase 20U
Total Volume 100μl
↓
37℃, 60min.
90℃, 2min.

缓慢降至室温
<寡核苷酸的标记>
灭菌蒸馏水 Xμl
底物DNA 10pmoles
10×Protruding End
Kinase Buffer 1μl
[γ-³²P]rATP(3000Ci/mmole) 3-6μl
T4 Polynucleotide Kinase 10U
Total Volume 10μl
↓
37℃, 30min.
95℃, 3min.

需要与寡核苷酸等摩尔以上的rATP。
10pmoles相当的各比活性如下所示。
3000Ci/mmole,10μCi/μl 3μl
6000Ci/mmole,10μCi/μl 6μl
10pmoles寡核苷酸的大体量如下所示。
15mer 50ng
17mer 56ng
20mer 66ng
24mer 80ng
27mer 90ng
30mer 100ng
正确的计算式在综合目录中有说明。

在此条件下，可得到约106cpm/pmole以上的标记寡核苷酸。

<5'末端突出的双链DNA的磷酸化>
灭菌蒸馏水 Xμl
纯化的DNA片段～1μg
10×Protruding End
Kinase Buffer 5μl
10mM rATP 5μl
T4 Polynucleotide Kinase 5μl (5～20U/μl)
Total Volume 50μl
↓
37℃, 60min.
可根据实验需要进行纯化

<平滑末端及3'末端突出的双链DNA的磷酸化>
灭菌蒸馏水Xμl
纯化的DNA片段～1μg
10×Blunt End
Kinase Buffer 5μl
10mM rATP 5μl
T4 Polynucleotide Kinase 5μl (5～20U/μl)
Total Volume 50μl
↓
37℃, 60min.
可根据实验需要进行纯化

<寡核苷酸的磷酸化>
寡核苷酸(50μM) 14μl
10×Protruding End
Kinase Buffer 2μl
10mM rATP 2μl
T4 Polynucleotide Kinase 2μl (5～20U/μl)
Total Volume 20μl
↓
37℃, 60min.
95℃, 5min.
↓
add:
50μl DW
↓
作为10μM 寡核苷酸溶液使用

●酶的搅拌
本酶虽然很少因稀释导致活性下降，但是搅拌会使活性变弱。
因此，请尽量避开Vortex等强力搅拌。

●PCR产物的磷酸化
PCR产物经常会含有很多夹杂物，所以用本酶进行磷酸化反应时，为提高效率，推荐预先用试剂盒进行纯化。可推荐MagExtractor^TM -PCR & Gel Clean up- 试剂盒。